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微囊蟲病
疾病代碼: DIS00199
建立日期: 2009/04/30
更新日期: 2009/05/07
作 者: 黃旭田
中文病名: 微囊蟲病
英文病名: Infection with Mikrocytos mackini
疾病描述: 1.病原:
病原型別:原蟲(protozoa)
病原環境:海水(marine)
學名:Mikrocytos mackini
病名(及俗名):微囊蟲病(Mikrocytosis)、丹名島病(Denman Islamd disease )、太平洋牡犡微細胞病(Microcell disease of Pacific oyster);另由魯夫來微囊虫(Mikrocytos roughleyi)所引發的疾病,稱為雪梨牡犡微細胞病(Microcell disease of Sydney rock oyster)、奧大利亞冬季病(Australian winter disease)。
最早發現者:Wolf & Elston(1988)
OLE狀況:表列(Listed)
病原摘要:
本病原在電子顯微鏡觀察下缺乏粒線體及單孢子體(haplosporosomes),微小細胞(2~4μm),非類球形外觀,在病原形態學上可分三種型態。
(1)靜止細胞(Quiescent cell, QC):卵圓形細胞核位於中央,含有少於7個嵴(seven cisternae)非活動性細胞核膜圍緣於高爾基體,具有少許泡狀及溶素樣體構造。
(2)泡狀細胞(Vesicular cell, VC):含有許多具外膜或不具外膜之泡狀細胞構造,缺乏細胞核膜圍緣於類輻射狀排列之高爾基體,細胞核膜具有擴張型之嵴管室(cisternal chamber)。
(3)內體細胞(Endosomal cell, EC):具有擴張性細胞核膜及生長良好吻合性內質網連結細胞核膜與漿膜,並具內體(endosomes)於細胞質中。
人畜共通:No
2.病原分類:
Cercozoa門、Endomyxa亞門、Ascetosporea綱、至目前止微囊虫(Mikrocytos)之分類對於是否歸屬單孢子虫類(Haplosporidans)尚有爭議未予明確類歸。(R)
命名沿革:
Mikrocytos mackini Farley,(Wolf & Elston, 1988)(R)?尚未確立

疾病特性:
本病原主要感染太平洋牡犡(C. gigas)、奧林匹亞牡犡(Olympia oysters; Ostrea conchaphila =Ostrea lurida),人工感染美國牡犡(Crassostrea virginica)及歐洲牡犡(Ostrea edulis),而鴨鵝蚌(geoduck clams, Panope abrupta)則具抵抗性。局部感染牡犡泡狀結締組織細胞(vesicular connective tissue cells)造成病灶區血淋巴球浸潤及組織壞死。一般當水溫低於10℃時,經過3至4月之病原潛伏感染則於4月到5月發生疾病,而嚴重感染較局限發生於養殖2年以上之牡體,死亡率在低水潮下約為30%,同時約10%感染之牡體可復原。
本病原感染牡犡組織,由Hine et al.(2001,R)顯微結構特徵及侵害靶的組織,而分為靜止期(QC)、泡狀期(VC)及內體期(EC)等三種型態,這些虫體型態彼此相互轉形;微囊虫易與其他微小細胞病原如波納米亞虫(Bonamia spp.)區別,因為微囊虫感染牡犡泡狀結締組織細胞、內收肌細胞(adductor muscle myocytes)很少感染血淋球細胞,同時本病原缺乏粒綫體及單孢子體(Haplosporosomes);因此,微囊虫必需寄生於宿主細胞內憑取獲得能量而驅使虫體生存下來;所以在被微囊虫寄生之宿主細胞內粒綫體,其超顯微結構可見管狀構造(tube-like structure)從感染之宿主細胞伸入虫體細胞質內以獲取粒綫體能量。
至於虫體型態的改變,由先由EC轉變為VC,再由VC轉為QC,然後QC再轉為EC,如此循環。虫體早期增殖分裂(假設為染色體及環形結構,與具二核,多核細胞態,bi & multinucleate form),可於EC至QC期觀察到此期之虫體變化狀態;從觀察數據的推論,從QC期於泡狀結締組織(vesicular connective tissue, VCT)內之均質性血淋球(hyalinocytes)移至肉收肌和心肌細胞(myocytes),然後轉變為VC,到最後階段在肌細胞內形成EC;各期虫體形態特徵,QC期缺乏明顯的細胞質胞器構造,如粒結體,內質網與功能性高爾基體,所以QC期虫體在宿主泡狀結締細胞內移行於內收肌與心肌之血淋巴,並從宿主細胞粒綫體獲得ATP能量,而EC期虫體保持緊密接近血淋球細胞質之粒綫體,從血淋球細胞核仁獲取核糖核蛋白(ribonucleoproteins),且進行內飲作用(endocytosing)取得肝醣,利用ATP行醣酵解作用(glycolysis),發展形成小管泡狀高爾基樣復合物(small tubulovesicular Golgi-like complex),以製造合成蛋白質。
疾病型態及流行病學
本病一般感染牡犡,大約形成次臨床(subclinical)感染症狀,至少潛伏3至4個月,如水溫低於10℃時,則被感之牡體產生疾病變狀;本病發生於北美西部沿岸養殖牡犡區,華盛頓州及加拿大英屬哥倫比亞,可能限制於加拿大喬治海峽(Strait of Georgia)及局部之英屬哥倫比亞溫哥華群島(Vancouver Island)附近。本病原可在實驗室中經同居(cohabitation)或接種發病牡體之均質物質而成立感染;但病原藉由何種方式進入感受性牡犡,至目前尚未清楚;唯一可推論虫體可能如波納米亞虫(Bonamia spp.)由血淋球進行吞噬作用,將虫體帶入血淋球細胞內。虫體可否在水體環境中生存多久,亦無資料報導,而發病牡體與同飼養牡犡群間之病原傳播,可藉由水柱傳染。
臨床症狀及病理學
發病牡體可在外套膜及觸鬚(palps)產生瘍或綠色疱,疾病經常顯見於2月至6月,而發病高峰期則見於4至5月,死亡率可達40%。大部份被感染之牡犡,在良好的飼養及管理及防疫措施下可復原,但於外套膜仍可見綠色疱,減少上市場的商品價值。
於發病牡體之外套膜、消化腺及觸鬚可見明顯的組織病理變化,一般可在泡狀組織細胞內,顯現2-4μm大小之虫體,有時可在鰓、結締組織、腸道、外套膜上皮、觸鬚竇狀隙組織間觀察到游離的虫體。
病原致病性意義
此病最早於1960年發生於丹名島之享利灣(Henry. Bay),當時在低水潮位下之養殖牡犡,造成30%之死亡率,從1960至1994年,於亨利灣養殖之太平洋牡犡,疾病發生於3月中旬至5月中旬,死亡率從11%(1967)至48%(1988),除死亡率外,發病牡體常見體壁、內收肌、外套膜及唇觸鬚表面,可見著局部綠色瘍樣5μm直徑大病灶,同時會在貝殼鄰近區域產生棕色斑痕。雖然本病原於夏季期間會對牡體形成持續性感染,但在養殖夏季期間例行之組織病理切片檢查卻無法來出病原。由實驗證據顯示當疾病於早春(4至5月)呈活躍狀態,但感染卻成隱性狀直到春季顯現疾病,特別在水溫低於10℃、塩度30至35ppt時,有利於病原的增殖,產生40%死亡率,約有10%遭受感染之太平洋牡犡會復原,而從實驗室接種試驗及田間條件調查太平洋牡犡似乎比其他種牡犡對本病較有抵抗性。
診斷方法: 一級初步診斷:
從發病牡體之內收肌,觸鬚及外套膜,特別從綠色疱病灶,行塗抹染色檢查,染色液可使用Wright、Wright-Giemsa或相當染色液如Haemacolor、Diff Quick,於檢下可見虫體呈現嗜鹼性細胞質、嗜酸性細胞核,外形似小球狀或卵圓形,具有二核融合細胞虫體(2至4μm寬),寄生或游離於泡狀細胞,有時寄生於血淋球內。
二級初步診斷:目前尚無培養此虫體的方法。
三級初步診斷:
由組織病理學鏡下觀察,從罹病牡體之泡狀結締組織細胞內可見2至3μm大小之寄生虫體,亦可於肌細胞或血淋球內觀察到病原;而魯夫來微囊虫(M. roughleyi奧洲冬季死亡症之病原,一般本病原為養殖雪梨牡犡(Saccostrea. commercialis)造成區別之重點,在於魯夫來微囊虫所感染寄生的宿主細胞質會於週邊,並取代細胞質產生空泡,稱為細胞質性空泡(cytoplasmic vacuole),而其他波納米亞虫(Bonamia spp.)與本病原無此變化特徵,同時魯夫來微囊虫每個感染階段都寄生於血淋球內,而本病原通常出現於損傷組織部位四週之空泡性結締組織細胞內,見附表一。
一級確定診斷:
於罹病牡蠣體壁、內收肌、外套膜及唇鬚表面可見黃綠色5mm直徑之疱,且常在外套膜表面之瘍">瘍病灶附近貝殼上留下棕色斑痕(brown scar)。
二級確定診斷:目前並無發現本病原具有特異性血清型。
三級確定診斷:
1.穿透式電子顯微鏡下檢查,予波納米亞虫之區別在於本病原核仁位於細胞核中央,並缺之粒線體及單孢子體之構造,而B. ostrea核仁呈偏側位置(eccentric location);至於本病原在電子顯微鏡下各種虫體形之變異,Hine et al,於2001年(R),有詳細的報導,本文前述已有介紹,本病原三個虫體型的變異,可在泡狀結締組織細胞及血淋球內發現,本病原為細胞內絶對寄生性原虫,觀察出虫體非常接近宿主細胞質內之粒綫體,此目的主要是獲居宿主細胞的能量來源。
2.使用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)從SSU rDNA區域分析,並設計出一組專一性之primers 5′-AGA-TGG-TTA-AGC-CTC-C-3′及5′-GCG-AGC-TGC-CAC-AAG-GC-3′估計放大之產物為546bp片段。在操作過程中,經淬取病原DNA後,加入各種反應物,並由最初變性(denaturation)94℃,10分鐘40循環、94℃、1分鐘,60.5℃、1分鐘,及72℃、1分鐘,最後之擴展72℃、10分鐘,其產物經1.5% agarose gal電泳,再由UV光檢測產物;詳細步驟可參閱世界動物衛生組織水生動物檢驗手冊(Manual of diagnostic for aquatic animals, 2006)第2.2.5章infectrin with Mikrocytos mackini之內容。
3.FISH及ISH
螢光原位雜交法(fluorescent in situ hybridization, FISH)之檢驗步驟設計,係使用4個oregon green標示於寡核苷酸探針上(oligonucleotide probes),其探針序列為Mackini-1-OG:AGC-CCA-CAG-CCT-TCA-C, Mackini-2-OG:CCG-CCC-TTC-TCA-
GGT-C; Mackini-3-OG:CGA-AAG-TGG-TAG-CTA-AAG;Mackini-4-OG:AGT-AGC-
CTG-CTT-CCA-CT再統各種操作程序,可參考Carnegie et al. 2003(R),發表之文獻。
原位雜交法(in situ hydridization, ISH),係經digoxignin標示探針Mackini-1-OG:
5′-AGC-CCA-CAG-CCT-TCA-C-3′-DIG上(Meyer et al. 2005,R),有效成功具專一性及敏感性的檢出本病原於消化腺、鰓、心臟、腎及腸管等組織。
4.定序(sequencing)
將PCR產物經DNA定序後,再與基因庫中編碼AF477623比較對照其親族關係,始可確診本病原。在世界動物衛生組織(OIE)中規定要確診本病原需經組織病理學(histopathology),抹片檢查(imprints),PCR及ISH、DNA定序及穿透式電子顯微鏡檢查均為陽性反應後,才能最後確診。
治療方法: 目前無適當的治療方法。
預防控制方法: 首先需避免將發病地區的牡蠣帶至他處行種苗繁殖,同時禁止發病地區再行飼養牡蠣,定期檢查虫體感染的程度;尤其需在發病區域改良飼養管理方法,在3月前減少收獲或移動年長的牡犡至高間潮區,在6月前不要種植牡犡於低潮間帶,同時在高發病區所飼養牡犡建議持續養殖至少2年為一週期之生產循環方式。因為經過實際田間飼養經驗,春季為增加死亡率之發病期。
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